Coilabo: travailler avec l'ADN

Stockage

   Les métaux lourds provoquent la cassure des liaisons phosphodiester. Si aucun métal lourd n'est présent, l'éthanol n'endommage pas l'ADN.
   L'EDTA est un excellent chélateur de métaux lourds. Les radicaux libres sont formés à partir à des cassures des liaisons chimiques.
   Les radiations peuvent casser les liaisons phosphodiester. La lumière UV à 260 nm peut causer différentes lésions, comme les dimères de thymine. L'activité biologique et rapidement perdue. Les radiations à 320 nm sont moins dangereuses.
   Le B. E. T. cause une photo-oxydation de l'ADN en lumière visible et en présence d'oxygène. Cette oxydation produit une cassure des liaisons phosphodiester.
On retrouve des nucléase sur la peau humaine, c'est pourquoi il faut éviter le contact direct ou indirect entre les acides nucléiques et les doigts. La plupart des DNAses ne sont pas très stables, cependant beaucoup de RNases sont très stables et peuvent s'adsorber sur le verre ou le plastique et rester actives.
   5 °C et l'une des plus simples et meilleures conditions pour stocker l'ADN. -20 °C : cette température cause des cassures sur le simple et double brin. -70 °C est une température excellente pour le stockage à long terme. Pour le stockage à long terme de l'ADN, il est préférable de garder dans un tampon hautement salin (> 1M) en présence d'EDTA (> 10mM) pH 8,5. Le stockage de l'ADN dans un phage est meilleur que le stockage d'une solution pure d'ADN. [Davis, R.W., D. Botstein and J.R. Roth, A manual for Genetic Engineering: advanced bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y. 1980]

Purification

Pour éliminer les protéines des solutions d'acides nucléiques:

1. traiter avec des enzymes protéolytiques, par exemple la pronase ou la protéinase K.

2. Extraction au phénol. La méthode la plus simple pour purifier l'ADN, le phénol dénature les protéines et l'extraction avec le chloroforme enlève les traces de phénol. Pour une utilisation plus efficace je vous conseille d'utiliser le phase lock gel d'Eppendorf (distribué par Fisher Sci.).

3.Gradient de densité CsCl/BET.

Quantification

1. Spectrophotométrique. Pour des solutions pures d'ADN, la méthode la plus simple et la quantification par absorbance à 260 nm, à cette longueur d'onde une D. O. de 1 pour un trajet d'une longueur de 1 cm vaut 50 µg/ml pour l'ADN double brin, 40 µg/ml pour l'ADN simple brin et l'ARN et 20 à 33 µg/ml pour les oligonucléotides. Le ratios des absorbances 260 nm / 280 nm donne une estimation de la pureté de la solution. Pour une solution pure, ce ratio est situé entre 1,8 et 2. Cette méthode n'est pas adaptée à deux faibles quantités d'ADN ou d'ARN (< 1 µg/ml).

2. Fluorescence avec le B. E. T.. La quantité d'ADN dans une solution est proportionnelle à la fluorescence émise par le B. E. T. dans cette solution. Des dilutions d'un ADN inconnu en présence de B. E. T. à 2 µg/ml est rapporté à une courbe étalon établie avec un ADN de quantité connue.

3.Fluorescence avec les kit Picogreen de Molécular Probes pour l'ADN double brin (Ribogreen pour l'ARN et Picogreen pour l'ADN simple brin). Dosage des acides nucléiques d'après l'établissement d'une courbe étalon, sensibilité de 25 pg/ml à 1 µg/ml.

Concentration

La manière la plus répandue est la précipitation à l'éthanol avec l'entraînement par un cation monovalent.
La concentration finale doit être de 2 à 2,5 M pour l'acétate d'ammonium

0,3 M pour l'acétate de sodium
0,2 M pour le chlorure de sodium
0,8 M pour le chlorure de lithium

   L'ion utilisé dépend souvent du volume d'ADN et des manipulations ultérieures, par exemple l'acétate de sodium inhibe la Klenow, les ions ammonium inhibent la kinase T4, les ions chlorure inhibent les ADN polymérases ARN dépendantes.

   L'ajout de MgCl2 à une concentration finale de 10 mM aide la précipitation des petits fragments ADN et des oligonucléotides. Après addition du cation monovalant, 2 à 2,5 volumes d'éthanol sont ajoutés, il faut bien mélanger puis stocker à -20 °C pendant 20 mn à 1 h.

   L'ADN est récupéré par centrifugation pendant 10 mn à 10 000 g minimum à 4 °C ou à température ambiante.
Le surnageant est éliminé soigneusement en faisant attention au culot d'ADN.

   Pour enlever les sels, le culot est lavé avec 0,5 à 1 ml d'éthanol à 70 %. Après une seconde centrifugation le culot est séché à l'air libre. L'acétate d'ammonium est très soluble dans l'éthanol et est très bien enlevé avec un lavage à 70 %
L'acétate de sodium le chlorure de sodium sont enlevés moins efficacement.

   Pour un séchage rapide, le culot peut-être passé brièvement dans un Speedvac, bien que cette méthode ne soit pas recommandée pour la plupart des préparations ADN car l'ADN trop sec est très difficile à dissoudre et tend à se dénaturer en petits fragments.

   On peut utiliser de l'isopropanol pour précipiter l'ADN mais alors les sels tendent à être co-précipités, cependant un volume moins important d'isopropanol est nécessaire pour précipiter l'ADN, ceci est pratique lorsque le volume est un facteur limitant.